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产品特点：采用精准的探针法荧光定量检测，确保准确性；

布氏杆菌荧光 PCR 检测试剂盒

使用说明书

用途

本试剂盒采用实时荧光PCR方法检测牛、羊、猪、马等牲畜的乳腺、淋巴结等组织病料和阴道分泌物、精液等液体病料中的布氏杆菌（BS）。适用于布氏杆菌感染的辅助诊断。试剂盒为预混体系，此体系包含荧光 PCR 检测所需的核酸扩增酶、反应 buffer 及特异性引物和探针，加入提取的样品 DNA 并补足 20 μL 体积的水后即可直接进行荧光 PCR 检测。

原理

在Taq 酶的作用下，经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异 DNA 片段的拷贝数放大，经荧光素标记的探针与扩增的 DNA杂交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。

储存条件及有效期

核酸提取试剂室温保存（蛋白酶K需要放置-20℃保存），扩增反应试剂置于-20℃保存。试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。

目录号：JC1001

包装规格：48次/盒

试剂盒组成

操作步骤

1、样品前处理

1.1组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1 g，手术剪剪碎混匀后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取上清液200 μL于1.5 mL灭菌离心管中；

1.2将拭子用无菌生理盐水沾湿，收集阴道分泌物、流产物、阴茎分泌物、眼鼻分泌物样品。再将拭子插入无菌生理盐水（多余部分掰断，盖好盖子），涡旋震荡混匀，取上清200 µL于1.5 mL灭菌离心管中；

1.3精液、尿液、乳汁、关节炎和水囊瘤液直接取200 μL于1.5 mL灭菌离心管中。

2、 DNA提取

2.1上述1.5mL离心管中加入200 µL结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀，再加入20 µL蛋白酶K (20 mg/mL)溶液（第一次使用蛋白酶K加入1mL灭菌水），充分混匀，70℃放置10 min。

2.2冷却后加入100 µL异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

2.3将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液（上述各步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15s混匀）。

2.4加入500 μL抑制物去除剂IR，12,000 rpm 离心30 s，弃废液。

2.5加入700 μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30 s，弃掉废液。

2.6加入500 μL漂洗液WB，12,000 rpm 离心30 s，弃掉废液。

2.7将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

2.8取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50 μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热），室温放置3-5 min，12,000 rpm 离心1 min。

2.9 DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

3、 检测步骤

3.1试剂的准备

从试剂盒中取出扩增反应试剂，冰上融化并振荡混匀后，10,000 rpm离心10 s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000 rpm离心10 s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15 μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照/阳性对照5 μL，10,000rpm瞬时离心10秒。

3.1 qPCR 反应循环条件设置

4、 结果说明

4.1结果分析条件设定

读取检测结果｡阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整｡

4.2试验有效判定

阳性对照的Ct值应小于30并出现特定扩增曲线｡阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线。

4.3结果描述及判定

4.3.1 阴性判定

无 Ct 值并且无特定扩增曲线｡

4.3.2 阳性判定

Ct 值≤35，且出现特定扩增曲线，样本判定阳性｡

4.3.3 可疑判定

对于Ct 值＞35的样本，如没有对数扩增曲线，则判为阴性；如有对数扩增曲线则判为可疑，可疑样本建议重提核酸后再次扩增。重做结果如仍是可疑，则判为样本阳性；否则判为阴性。